Introducción
El método de cultivo con polímero superabsorbente se basa en un principio fundamental: reproducir condiciones lo más cercanas posible al medio natural, sin recurrir a plantas genéticamente modificadas ni a sustratos artificiales complejos. A diferencia de los protocolos en medio de agar estéril, este enfoque tolera cierta actividad microbiana en las placas de Petri, siempre que no comprometa la calidad de los cultivos ni de las observaciones.
El sustrato de cultivo está formado por dos materiales complementarios:
- La vermiculita, un material completamente mineral bien tolerado por las plantas y los hongos. Su principal inconveniente es su opacidad, que impide la observación directa de las estructuras radiculares y fúngicas.
- El polímero superabsorbente, hidratado con una solución nutritiva, constituye un sustrato transparente. Las raíces y las hifas se desarrollan libremente en él, lo que permite observar en tiempo real la actividad simbiótica sin perturbar el sistema.
Al combinar estos dos sustratos en una placa de Petri bicompartimentada, resulta posible cultivar simultáneamente la planta huésped y su pareja fúngica, conservando al mismo tiempo un acceso visual directo a la zona de interacción simbiótica.
Al combinar la vermiculita y el polímero en una placas de Petri bicompartimentada, se puede observar el hongo y algunas raíces en el compartimento del polímero.
Parámetros esenciales del cultivo
Plantas naturales
Los cultivos se realizan con plantas e inóculo fúngico no esterilizados. Este enfoque busca mantener las condiciones más naturales posibles.
Riego y humedad
Mantener una humedad regular es esencial, pero hay que evitar dos extremos: la inundación prolongada de las placas de Petri, por un lado, y la deshidratación completa, por otro. Las raíces y las hifas necesitan agua y oxígeno.
Es importante entender que el establecimiento de la simbiosis micorrízica se basa en intercambios de señales químicas entre la planta y el hongo. Estos intercambios requieren un medio acuoso, al menos a escala microscópica. En la práctica, el riego se realiza cada cuatro días.
Iluminación:
Se aplica una iluminación LED de intensidad moderada según un ciclo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Aquí se aplica una regla fundamental: el follaje debe recibir la luz, pero las raíces deben permanecer permanentemente en la oscuridad. Se coloca una caja u otro dispositivo opaco alrededor de las placas de Petri para asegurar esta separación.
Una caja u otro dispositivo mantiene las raíces en la oscuridad mientras el follaje recibe iluminación.
Placas de Petri
El uso de placas de Petri presenta una ventaja práctica considerable: pueden apilarse en lotes de 6 a 8, lo que permite organizar fácilmente un centenar de cultivos en un solo estante, optimizando así el espacio de laboratorio.
Duración de un cultivo
Un ciclo de cultivo completo dura generalmente tres meses. Para la mayoría de las especies, seis semanas suelen ser suficientes para constatar visualmente el establecimiento de la simbiosis. Con especies de crecimiento rápido como Rhizophagus irregularis, es posible observar las primeras hifas desde los 10 días posteriores a la inoculación. Más allá de tres meses sin resultados visibles, es razonable concluir que la simbiosis no se establecerá.
Los cultivos bien mantenidos pueden permanecer activos durante más de 12 meses, lo que permite dar seguimiento a la evolución de la simbiosis.
Ausencia por vacaciones
Los cultivos toleran bien un período de latencia en el refrigerador a 4 °C en la oscuridad. Las plantas entran en latencia y reanudan su desarrollo normalmente cuando se colocan de nuevo a temperatura ambiente bajo iluminación habitual. Los cultivos se colocan en lotes dentro de bolsas herméticas tipo ziploc. Algunos cultivos han sobrevivido sin problemas más de 30 días en el refrigerador; dos semanas de conservación constituyen, por lo tanto, una duración perfectamente razonable.
Limpieza sin esterilidad
Las manipulaciones no requieren esterilidad estricta, pero exigen un rigor de limpieza. Se recomienda esterilizar los instrumentos a la llama y desinfectarse las manos con alcohol. Las soluciones nutritivas se tratan con luz ultravioleta (un dispositivo tipo Steripen) para reducir la carga de posibles contaminantes.
Acerca de los contaminantes:
¿Contaminantes o ayudantes naturales?
La distinción entre contaminantes y ayudantes naturales no es sencilla. Está bien documentado que ciertas bacterias afectan positivamente a los hongos; en inglés se las llama “mycorrhiza helper bacteria” (bacterias auxiliares de la micorriza). El cultivo axénico priva a los hongos de estas bacterias, mientras que el cultivo no estéril sobre el polímero tolera la presencia de bacterias.
En microbiología se trabaja principalmente con cultivos axénicos puros, mientras que en el mundo animal, para considerar sano a un animal, suele exigirse la presencia de una microbiota intestinal saludable. Quizás los hongos “sanos” también necesiten su propia microbiota en la hifosfera. El cultivo con el polímero busca permitir la presencia viva de esta hifosfera.
Principio general: limitar las fuentes de nutrientes
Para desalentar la proliferación excesiva de contaminantes, conviene no añadir azúcares, lípidos ni vitaminas a las placas de Petri ni a la solución nutritiva. En ausencia de fuentes de energía orgánicas, la mayoría de los contaminantes no pueden desarrollarse de forma significativa. Se presume, sin embargo, que los exudados de las raíces y de las hifas podrán alimentar una cierta vida bacteriana.
Algas microscópicas
Las algas microscópicas son transportadas por el aire y encuentran en el polímero hidratado todas las condiciones necesarias para su rápida multiplicación: agua y minerales. La estrategia de control es simple y eficaz: mantener el polímero en la oscuridad. Las algas no parecen perjudicar los cultivos en sí, pero su proliferación puede perjudicar las observaciones.
Bacterias
Sin esterilidad, la presencia de bacterias en los cultivos es inevitable y natural: proceden del aire ambiente y de las manipulaciones. En el suelo natural, los hongos micorrízicos coexisten con miles de especies bacterianas. En ausencia de nutrientes orgánicos en las placas de Petri, su desarrollo permanece limitado. Algunos datos incluso sugieren que podrían favorecer la simbiosis. Este tema constituye un campo de investigación todavía muy abierto.
Protistas
También aparecen protistas en las placas de Petri, transportados por el aire. Se alimentan principalmente de las bacterias presentes y no parecen perjudicar los cultivos. Su presencia sugiere una cierta vitalidad del microcosmos que se desarrolla en las placas de Petri. Entre ellos, se observan a veces amebas testáceas, reconocibles por su caparazón mineralizado — que no debe confundirse con esporas fúngicas.
Microhongos y mohos
También aparecen microhongos de forma ocasional en las placas de Petri. Su crecimiento es generalmente lento y poco invasivo. Habitualmente no comprometen de manera significativa los cultivos ni las observaciones. También forman parte integral del medio natural.
Ocasionalmente, se desarrollan microhongos en la vermiculita o sobre el polímero. Habitualmente estos no se desarrollan de manera invasiva ni perjudican significativamente los cultivos.
Para distinguir los microhongos contaminantes de los hongos micorrízicos arbusculares, la siguiente tabla presenta algunos elementos distintivos:
| Microhongos | Hongos micorrízicos arbusculares |
| Hifas muy finas, de pocas micras | Hifas anchas y gruesas, a menudo de más de 10 micras de diámetro |
| Hifas septadas. | Hifas cenocíticas |
| Citoplasma inmóvil (en apariencia) | Circulación bidireccional rápida dentro de las hifas. |
| Esporas minúsculas, de solo unas pocas micras. | Esporas generalmente de 25 a 200 micras según la especie. |
Rotíferos
Los rotíferos introducidos experimentalmente en las placas de Petri han prosperado durante varios meses, presumiblemente alimentándose de bacterias, sin causar daños a los cultivos. Su presencia da testimonio de la estabilidad del entorno creado por este método de cultivo.
Insectos
La presencia de larvas de mosca o de ácaros araña constituye el único caso de contaminación que ha justificado la destrucción sistemática de las placas de Petri. En estos casos, la medida correctiva es inequívoca: eliminar los cultivos afectados para evitar cualquier propagación.