Une bonne conception des boîtes de Petri est essentielle pour le développement de la plante, du champignon, pour permettre les observations et finalement pour une gestion de cultures qui ne soit pas trop exigeante en temps.
Les instructions qui suivent diffèrent légèrement de la publication originale dans la revue Symbiosis ou JOVE car elles intègrent des améliorations et observations postérieures à la publication. Les contenus demeurent toutefois valides.
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- Principes généraux sur la fabrication
- Matériel de base
- Fabrication du couvercle
- Préparation de la base de la boîte de Petri
- Fixation de la membrane de Nitex
- Montage des boîtes de Petri
- Guide de planification et fabrication, étape par étape
- Liens vers les publications formelles
Principes généraux sur la fabrication:
On utilise des boîtes de Petri bicompartimentées afin d’offrir à la plante et au champignon deux milieux différents et complémentaires:
- Le compartiment avec vermiculite ressemble au milieu naturel. La vermiculite ne contient pas beaucoup d’eau et est opaque à l’observateur
- Le compartiment avec le polymère est compatible avec les racines et les hyphes. Il constitue une réserve d’eau et de nutriments en plus de présenter une bonne transparence, ce qui permet d’observer en direct la symbiose.
- Les deux compartiments sont séparés par une membrane afin que les racines n’envahissent pas le compartiment de polymère. Trop de racines nuisent à l’observation.
- La plante et le feuillage requièrent de la lumière alors que les racines doivent être maintenues dans l’obscurité
- La matériel et les outils dois être propres même si la stérilité n’est pas présente.
Matériel de base:
Boîtes de Petri bicompartimentée de 90 mm et membrane de Nitex (ou équivalent). Les racines de Plantago lanceolata traversent aisément les mailles de taille supérieure à 60 µm, donc j’utilise 35µm ou moins.
Fer à pyrogravure avec guide de coupe de 50 mm et clip à papier (Voir la vidéo « Fixation à la chaleur plus bas »).
Pour tailler le plastique de la boîte, on utilisera un outil rotatif de type « Dremel ». Ici j’utilise les mèches Dremel no 199, 194 et 116.
Colle qui durcit à l’ultraviolet, un applicateur avec une pointe fine ainsi qu’une lampe à ultra-violet puissante.
Fabrication du couvercle:
Avec l’outil rotatif, percer deux trous d’environ 5 à 6 mm qui serviront pour l’irrigation dans chaque compartiment, ainsi qu’une ouverture sur le côté par où sortira la tige de la plante. Le même couvercle servira pour toutes les variantes de la base des boîtes de Petri qui sont décrites plus bas.
Préparations de la base de la boîte de Petri
J’ai utilisé trois variantes de dispositifs afin de respecter les principes généraux:
Boîtes de Petri avec une petite ouverture dans la barrière centrale. Aucune membrane de Nitex n’est utilisée. Seules quelques racines traverseront du coté polymère (à court terme) ainsi que les hyphes évidemment. Très simple à fabriquer, mais ce n’est pas le modèle le plus performant.
Boîte de Petri avec une ouverture de 40 mm sur la barrière centrale. Scellée avec la membrane de Nitex (chaleur ou colle). Très efficace même sur le long terme, les hyphes sont rapidement perceptibles du coté polymère.
Variante du modèle précédent, avec une fente horizontale dans la barrière centrale réalisée avec la mèche #199. Il est plus simple à fabriquer que l’ouverture de 40 mm et aussi performant.
Toutes les ouvertures dans les boîtes de Petri se font avec un outil rotatif qui ne dégage aucune fumée ni substances toxiques. Les gants évitent de faire des traces de doigts sur les boîtes.
Pour l’imagerie en haute définition
Il est possible d’effectuer une ouverture dans le plancher de la boîte de Petri et d’y fixer une lamelle de 0,17 mm d’épaisseur. J’effectue une ouverture circulaire de 25 mm de diamètre et des lamelles ronde des 30 mm de diamètre avec la colle ultra-violet. Il est important de fixer la lamelle sous la boîte de Petri de manière à pouvoir nettoyer l’huile à immersion après usage. Le verre est peu transparent à la lumière ultraviolette, on doit donc fixer les lamelles plus longtemps afin que la colle soit bien durcie. On doit aussi s’assurer que les racines ne puissent s’insérer entre la boîte de Petri et la lamelle en bouchant avec la colle toutes les micro-ouvertures possible.
Dans la vidéo (lien en bas de page), on colle la lamelle avec de la colle à aquarium. J’ai constaté par la suite que la colle ultraviolette, bien durcie, colle plus fermement et résiste mieux aux racines.
Lorsque les hyphes vont se développer, par géotropisme, certains vont se placer directement sur la lamelle. En inversant la boîte de Petri sur le microscope, on pourra réaliser des images à fort grossissement, avec huile à immersion.
J’ai ici marqué le bord de l’ouverture de la boîte de Petri et de la lamelle (avant de la coller) au crayon feutre pour mieux visualiser les éléments.
Lamelle collée et bien en place. Notez que la membrane de Nitex n’a pas été placée ici afin de mieux visualiser la montage.
Fixation de la membrane de Nitex
La membrane de Nitex est toujours placée du coté du plantule (vermiculite). Il existe deux méthodes de fixation de la membrane: Fusion à la chaleur et colle qui durcit à la lumière ultra-violette.
La fusion à la chaleur requiert un peu plus de manipulations que la colle, mais ne comporte aucun produit chimique additionnel. Elle est parfaitement stable sur la longue durée.
La colle ultra-violette est rapide et simple à appliquer, mais elle introduit des produits chimiques additionnels dans la boîte de Petri, surtout si elle n’est pas parfaitement durcie. Elle comporte aussi un risque de décollement sur le long terme lorsqu’elle est submergée dans le liquide très longtemps.
Fixation à la chaleur avec l’outil de pyrogravure:
Il s’agit ici de faire fondre et fusionner la membrane dans le plastique de la boîte de Petri avec un outil de pyrogravure. Cette fusion n’ajoute aucun produit chimique à la boite. Cette méthode est bien décrite dans la publication de Symbiosis:
Ainsi que dans la vidéo JOVE suivante, en anglais, à partir de la minute 2:50.
https://www.jove.com/v/66848/author-spotlight-enhancing-am-fungi-research-with-sap-as-novel
Voici néanmoins quelques illustrations et informations additionnelles sur le procédé:
On observe sur la photo ci-bas les outils de base: Fer à pyrograver avec la pointe qui servira à fondre/fusionner la membrane sur la plastique du Nitex. La pointe ne doit pas être coupante, ni trop grossière. Clip à papier mauve qui sert tenir en place la membrane et le guide de coupe sur la barrière centrale. Morceau de Nitex taillé plus grand que le guide de coupe et que l’ouverture dans la barrière. Le guide de coupe/fusion est constitué d’un simple morceau de métal mince. Les coins ronds facilitent le glissement de la pointe de pyrogravure.
On détaille ici l’assemblage. En contact direct avec le plastique, on place la membrane. Par dessus la membrane, on place le guide de coupe/fusion. Le fer à pyrogravure chaud suivra le contour de ce guide de coupe. Une pince à papier tient les éléments en place pendant qu’on exécute la manœuvre de fusion. La pince à papier tient le tout en place et s’accroche à la barrière centrale derrière. L’ouverture de la barrière centrale est donc PLUS PETITE que le guide de coupe et que la pince.
La pointe chauffée fera fondre et fusionner la membrane de Nitex avec la boîte de Petri le long du guide de coupe selon la ligne rouge. La membrane est toujours placée du coté vermiculite, soit du coté des racines, . Si on place la membrane de l’autre coté, les racines s’insèrent entre la membrane et le plastique, poussent et traversent aisément de l’autre coté. Lorsque la fusion est terminée, sans retirer la pince qui maintient la membrane bien en place, utiliser une pincette pour retirer l’excédent de membrane inutile. Finalement, démonter le tout délicatement et c’est prêt pour utilisation.
Le résultat final doit ressembler à ceci. La coche permet de placer un plantule adéquatement, la membrane est fixée côté racine/vermiculite, l’excédent de membrane a été retiré.
Fixation de la membrane avec la colle ultra-violette:
C’est maintenant la méthode que je préfère, c’est plus rapide et plus simple à fabriquer que la fixation a la chaleur. Le temps de durcissement variera en fonction de la marque de colle et de votre lampe. En pratique, je constate qu’il est préférable d’exposer à la lumière UV la colle beaucoup plus longtemps que ce qu’indique le fabriquant pour que la colle résiste longtemps à l’eau. La colle UV n’est toutefois pas parfaite et il arrive occasionnellement qu’elle décolle après de longues immersions. De plus, il est possible que la colle UV conserve un mince film non polymérisée à sa surface, même après exposition à la lumière UV. Cette pellicule pourrait (potentiellement) présenter une certaine toxicité pour les plants ou champignons.
Assurez-vous que la longueur d’ondes de votre lampe soit compatible avec votre colle et que sa puissance et le temps de durcissement soit suffisant. Protégez vos yeux et votre peau des UV.
Taillez un morceau de Nitex environ 14 X 50 mm. et effectuez un pli d’environ 4 à 5 mm. sur la longueur.
Appliquez la colle sur le compartiment mitoyen (verticalement) et sur la base là où collera la membrane.
Déposez le morceau de membrane sur la colle, un plaçant le pli dans le coin. La section de 5 mm va au plancher.
Cliquez ici pour savoir comment faire le pli.
Appliquez la lumière UV immédiatement pour bien immobiliser la membrane en place. La colle ne doit pas imbiber et sceller la section verticale de la membrane de Nitex.
Faites un deuxième passage de colle pour s’assurer que la membrane est bien collée sur toute la longueur et qu’aucune racine ne puisse s’insérer sous la membrane. S’assurer du bon durcissement de la colle. La colle insuffisamment durcie a tendance à décoller sous l’effet de l’humidité et de l’eau.
Montage des boîtes de Petri:
Déposez une plantule disposant d’une radicelle de quelques cm. Les manipulations se font sans stérilité avec les doigts, propres ou gantés. Les pincettes ont tendance à briser les fragiles plantules.
J’utilise ensuite une vermiculite fine, dont les grains ne font que quelques millimètres. Une règle millimétrique donne l’échelle ici.
Déposez environ 2 gr de vermiculite par dessus la plantule et s’assurant que la tige demeure orientée vers l’extérieur. Ajouter environ 8 ml de solution nutritive pour gorger de liquide la vermiculite.
Ma variante préférée: Placez la vermiculite en demi-cercle et environ 5 gr de polymère au centre. Ça facilite la détection précoce des jeunes racines ainsi que des hyphes. Cela permet aussi la détection des hyphes ou spores des espèces qui préfèrent la proximité des racines.
Déposez environ 15 gr de polymère dans le compartiment opposé. Le polymère doit bien entrer en contact avec la membrane de Nitex afin de faciliter le passage du champignon vers le compartiment de polymère.
Placez le couvercle et scellez avec un ruban de paraffine afin de main tenir le couvercle en place. Attention à ne pas « guillotiner » le plantule. Peser la boîte car le poids servira de référence pour l’irrigation.
Assemblage avec de très petits plantules:
Certaines plantes, telles Fragaria vesca ou Plantago coronopus ont des plantules si minuscules qu’on ne peut pas les placer au fond de la boîte de Petri. Dans ces cas, on déposera les plantules sur la vermiculite bien humidifiée et très délicatement, on replacera quelques grains de vermiculite par-dessus les racines pour leur assurer un micro-environnement humide. Il ne faut pas hésiter à travailler sous le stéréomicroscope pour ces opérations.
Replacer des plantules:
Il arrive qu’un jeune plantule se développe au mauvais endroit, sous le couvercle, il ne faut pas hésiter à ouvrir le couvercle et le replacer délicatement.
Guide de planification, étape par étape
- Matériel
- Gants
- Protection pour les oreilles et les yeux, notamment contre la lumière ultra-violette si requis
- Optionnel, hotte pour les quelques fumeroles
- Boîtes de Petri bi-compartimentées
- Membrane de Nitex avec mailles de 30 µm ou moins
- Crayon feutre et alcool pour nettoyer
- Règle millimétrique
- Guides de coupe/soudure en métal
- Outil de pyrogravure et pointes appropriées ( au moins une)
- Outil rotatif et pointes appropriées (probablement trois)
- Ciseaux (pour la membrane de Nitex)
- Petit grattoir de métal
- Colle qui durcit à l’ultra-violet
- Lampe ultra-violet et protection adéquate
- Loupe binoculaire (pour vérifier le travail final)
- Gabarit
- Aspirateur ou jet d’air (pour nettoyer les boîtes de Petri des poussières débris de coupe)
- Tailler les couvercles
- Percer les trous du dessus du couvercle ainsi que l’ouverture du coté avec l’outil rotatif ( illustré ici) et la même mèche. Cette opération peut se faire sans gabarit. Bien aligner en ligne droite les trois ouvertures.
- Tailler l’ouverture de coté des boîtes de Petri.Sans changer la mèche utilisée pour les couvercles, taillez toutes les ouvertures. Les ouvertures de coté font face à la barrière centrale.
- Marquer au crayon feutre les dimensions pour les ouvertures centrales
- Marquer au crayon feutre les dimensions pour l’ouverture ronde si on désire coller des lamelles pour la haute définition. L’ouverture ronde est toujours du coté polymère (opposé à l’ouverture) et généralement en biais par rapport à l’ouverture du couvercle afin de ne pas irriguer directement au-dessus de la lamelle. L’ouverture ronde est marquée SOUS la boîte de Petri, afin de pouvoir l’effacer ensuite.
- À l’aide de l’outil rotatif, tailler les ouvertures dans la barrière centrale.
- À l’aide de l’outil rotatif, tailler l’ouverture rondes dans le fond de la boîte.
- Généralement, on gruge les lignes de manière à ne pas avoir à l’effacer. Au besoin, on peut effacer les marques restantes avec de l’alcool.
- À l’aide d’un petit grattoir, nettoyer et enlever toutes les aspérités de plastique fusionnées qui peuvent nuire au placement de la membrane de Nitex ou de la lamelle. Ceci est particulièrement important pour les lamelles qui seront collées sous la boîte.
- Utiliser un jet d’air pour bien nettoyer les boÎtes.
- Tailler les morceaux de membrane de Nitex à l’aide de ciseaux ou autre.
- Effectuer un pli dans la membrane (optionnel) tel qu’illustré ici dans la membrane pour faciliter le placement, surtout si on utilise la colle.
- Option 1) Fixer la membrane de Nitex à la chaleur et tel qu’illustré plus haut.
- Option 2) Fixer les membranes avec colle ulra-violette tel qu’illustré plus haut Notez que la longueur d’onde ultraviolette pour les colles est habituellement différente des longueurs d’ondes pour stériliser du matériel. Il faut donc une lumière spécifique adaptée a la colle utilisée.
- Coller les lamelles sous les boîtes de Petri pour observation en haute définition tel qu’illustré plus haut. Les lamelles doivent être collées sous la boîte afin de pouvoir les nettoyer. Cette opération se fait idéalement en plusieurs petites étapes:
- Le trou a été percé
- placer la colle UV le long du trou formant un cercle fermé.
- Déposer la lamelle sur la colle en s’assurant que tout est parfaitement scellé. Utiliser une pincette afin de faire un dépôt propre et sans bavures.
- Durcir la colle avec la lampe ultra-violet, tout en protégeant la peau et les yeux selon les instructions.
- Retourner la boîte de Petri et mettre un mince cordon de colle le long du joint afin de ne laisser aucune mini-ouverture pour qu’une racine s’insère entre la lamelle et le pétri, auquel cas où la racine pousserait et décollerait la lamelle. Durcir encore à la lumière UV le dernier cordon de colle.
Liens vers les publications officielles
Le lien qui suit mène directement vers la vidéo de fabrication d’un pétri avec la méthode de pyrogravure.
https://www.jove.com/v/66848/author-spotlight-enhancing-am-fungi-research-with-sap-as-novel