Un buen diseño de las placas de Petri es esencial para el desarrollo de la planta y del hongo, para permitir las observaciones y, finalmente, para una gestión de los cultivos que no exija demasiado tiempo.
Las instrucciones que siguen difieren ligeramente de la publicación original en las revistas Symbiosis o JOVE, ya que incluyen mejoras y observaciones posteriores a la publicación. El contenido, sin embargo, sigue siendo válido.
Menú
- Principios generales de fabricación
- Materiales básicos
- Fabricación de la tapa
- Preparación de la base de la placa de Petri
- Fijación de la membrana de Nitex
- Montaje de las placa de Petri
- Guía de planificación y fabricación, paso a paso
- Enlaces a las publicaciones formales
Principios generales de fabricación:
Se utilizan placas de Petri bicompartimentadas para ofrecer a la planta y al hongo dos medios diferentes y complementarios:
- El compartimento con vermiculita se asemeja al medio natural. La vermiculita no contiene mucha agua y es opaca para el observador
- El compartimento con el polímero es compatible con las raíces y las hifas. Constituye una reserva de agua y nutrientes, además de presentar una buena transparencia, lo que permite observar en directo la simbiosis.
- Los dos compartimentos están separados por una membrana para que las raíces no invadan el compartimento de polímero. Demasiadas raíces perjudican la observación.
- La planta y el follaje requieren luz, mientras que las raíces deben mantenerse en la oscuridad
- El material y las herramientas deben estar limpios, aunque la esterilidad no sea necesaria.
Materiales básicos:
Placa de Petri bicompartimentada de 90 mm y membrana de Nitex (o equivalente). Las raíces de Plantago lanceolata atraviesan fácilmente las mallas de tamaño superior a 60 µm, por lo que utilizo 35 µm o menos.
Herramienta de pirograbado con guía de corte de 50 mm y un clip de papel (ver el vídeo “Fijación con calor” más abajo).
Para cortar el plástico de la Placa de Petri, se utilizará una herramienta rotativa tipo “Dremel”. Aquí utilizo las brocas Dremel n.º 199, 194 y 116.
Pegamento que se cura con luz ultravioleta, un aplicador con punta fina y una lámpara ultravioleta potente.
Fabricación de la tapa:
Con la herramienta rotativa, perforar dos agujeros de unos 5 a 6 mm que servirán para la irrigación en cada compartimento, así como una abertura lateral por donde saldrá el tallo de la planta. La misma tapa se utilizará para todas las variantes de la base de las placas de Petri descritas más abajo.
Preparación de la base de la placa de Petri
Utilicé tres variantes de dispositivos para respetar los principios generales:
Placa de Petri con una pequeña abertura en la barrera central. No se utiliza membrana de Nitex. Solo algunas raíces atravesarán al lado del polímero (a corto plazo), así como las hifas, evidentemente. Muy sencilla de fabricar, pero no es el modelo más eficaz.
Placa de Petri con una abertura de 40 mm en la barrera central, sellada con la membrana de Nitex (calor o pegamento). Muy eficaz incluso a largo plazo; las hifas se perciben rápidamente en el lado del polímero.
Variante del modelo anterior, con una ranura horizontal en la barrera central realizada con la broca #199. Es más sencilla de fabricar que la abertura de 40 mm y también eficaz.
Todas las aberturas de las placas de Petri se realizan con una herramienta rotativa que no desprende humo ni sustancias tóxicas. Los guantes evitan dejar marcas de dedos en la placa de Petri.
Para la obtención de imágenes en alta definición
Es posible realizar una abertura en el fondo de la placa de Petri y fijar allí un cubreobjetos de 0,17 mm de espesor. Yo hago una abertura circular de 25 mm de diámetro y uso cubreobjetos redondos de 30 mm de diámetro con pegamento de curado ultravioleta. Es importante fijar el cubreobjetos debajo de la placa de Petri para poder limpiar el aceite de inmersión después de su uso. El vidrio es poco transparente a la luz ultravioleta, por lo que hay que curar los cubreobjetos durante más tiempo para que el pegamento endurezca bien. También hay que asegurarse de que las raíces no puedan introducirse entre la placa de Petri y el cubreobjetos, sellando con pegamento todas las posibles microaberturas.
En el vídeo (enlace al final de la página), el cubreobjetos se pega con pegamento para acuarios. Posteriormente comprobé que el pegamento ultravioleta, bien curado, pega con más firmeza y resiste mejor a las raíces.
A medida que las hifas se desarrollan, por geotropismo, algunas se colocarán directamente sobre el cubreobjetos. Al invertir la placa de Petri en el microscopio, se pueden obtener imágenes con gran aumento, usando aceite de inmersión.
Aquí marqué el borde de la abertura de la placa de Petri y del cubreobjetos (antes de pegarlo) con un rotulador para visualizar mejor los elementos.
Cubreobjetos pegado y bien colocado. Nótese que la membrana de Nitex no se colocó aquí para poder visualizar mejor el montaje.
Fijación de la membrana de Nitex
La membrana de Nitex siempre se coloca del lado de la plántula (vermiculita). Existen dos métodos para fijar la membrana: fusión por calor y pegamento que cura con luz ultravioleta.
La fusión por calor requiere un poco más de manipulación que el pegamento, pero no implica ningún producto químico adicional. Es perfectamente estable a largo plazo.
El pegamento ultravioleta es rápido y sencillo de aplicar, pero introduce productos químicos adicionales en la placa de Petri, sobre todo si no está perfectamente curado. También conlleva el riesgo de despegarse a largo plazo cuando permanece sumergido en líquido durante mucho tiempo.
Fijación con calor mediante la herramienta de pirograbado:
Se trata de fundir y fusionar la membrana con el plástico de la placa de Petri mediante una herramienta de pirograbado. Esta fusión no añade ningún producto químico a la placa de Petri. Este método está bien descrito en la publicación de Symbiosis:
Así como en el siguiente vídeo de JOVE, en inglés, a partir del minuto 2:50.
https://www.jove.com/v/66848/author-spotlight-enhancing-am-fungi-research-with-sap-as-novel
A continuación, algunas ilustraciones e información adicional sobre el proceso:
En la foto de abajo se observan las herramientas básicas: herramienta de pirograbado con la punta que servirá para fundir/fusionar la membrana con el plástico del Nitex. La punta no debe ser afilada ni demasiado gruesa. Clip de papel morado que sirve para mantener en su sitio la membrana y la guía de corte sobre la barrera central. Trozo de Nitex cortado más grande que la guía de corte y que la abertura en la barrera. La guía de corte/fusión consiste en un simple trozo de metal fino. Las esquinas redondeadas facilitan el deslizamiento de la punta de pirograbado.
Aquí se detalla el montaje. En contacto directo con el plástico se coloca la membrana. Encima de la membrana se coloca la guía de corte/fusión. La herramienta de pirograbado caliente seguirá el contorno de esta guía de corte. Un clip de papel mantiene los elementos en su sitio mientras se realiza la maniobra de fusión. El clip de papel sujeta todo en su sitio y se engancha a la barrera central detrás. La abertura de la barrera central es, por tanto, MÁS PEQUEÑA que la guía de corte y que el clip.
La punta calentada fundirá y fusionará la membrana de Nitex con la placa de Petri a lo largo de la guía de corte, siguiendo la línea roja. La membrana siempre se coloca del lado de la vermiculita, es decir, del lado de las raíces. Si se coloca la membrana del otro lado, las raíces se introducen entre la membrana y el plástico, crecen y atraviesan fácilmente hacia el otro lado. Una vez terminada la fusión, sin retirar el clip que mantiene la membrana bien colocada, utilizar unas pinzas para retirar el exceso de membrana innecesario. Finalmente, desmontar todo con cuidado y estará listo para su uso.
El resultado final debe parecerse a esto. La muesca permite colocar una plántula adecuadamente, la membrana está fijada del lado de la raíz/vermiculita, y el exceso de membrana ha sido retirado.
Fijación de la membrana con pegamento ultravioleta:
Este es ahora el método que prefiero, es más rápido y sencillo de realizar que la fijación por calor. El tiempo de curado variará según la marca del pegamento y su lámpara. En la práctica, considero preferible exponer el pegamento a la luz UV durante mucho más tiempo del que indica el fabricante, para que el pegamento resista bien el agua a largo plazo. Sin embargo, el pegamento UV no es perfecto y en ocasiones se despega tras inmersiones prolongadas. Además, es posible que el pegamento UV conserve una fina película no polimerizada en su superficie, incluso después de la exposición a la luz UV. Esta película podría (potencialmente) presentar cierta toxicidad para las plantas u hongos.
Asegúrese de que la longitud de onda de su lámpara sea compatible con su pegamento y que su potencia y tiempo de curado sean suficientes. Proteja sus ojos y su piel de los rayos UV.
Corte un trozo de Nitex de aproximadamente 14 x 50 mm y haga un pliegue de unos 4 a 5 mm a lo largo.
Aplique el pegamento en la pared del compartimento contiguo (verticalmente) y en la base, donde se pegará la membrana.
Coloque el trozo de membrana sobre el pegamento, poniendo el pliegue en la esquina. La sección de 5 mm va hacia el suelo.
Haga clic aqui para saber cómo hacer el pliegue.
Aplique la luz UV inmediatamente para inmovilizar bien la membrana en su sitio. El pegamento no debe empapar ni sellar la sección vertical de la membrana de Nitex.
Aplique una segunda pasada de pegamento para asegurarse de que la membrana esté bien pegada en toda su longitud y que ninguna raíz pueda introducirse bajo la membrana. Asegúrese del buen curado del pegamento. El pegamento insuficientemente curado tiende a despegarse por efecto de la humedad y el agua.
Montaje de las placas de Petri:
Coloque una plántula con una raicilla de unos pocos cm. La manipulación se realiza sin esterilidad, con los dedos limpios o enguantados. Las pinzas tienden a romper las frágiles plántulas.
Luego utilizo una vermiculita fina, cuyos granos miden solo unos milímetros. Una regla milimetrada da la escala aquí.
Coloque unos 2 g de vermiculita sobre la plántula, asegurándose de que el tallo quede orientado hacia el exterior. Añada unos 8 ml de solución nutritiva para saturar de líquido la vermiculita.
Mi variante preferida: Coloque la vermiculita en semicírculo y unos 5 g de polímero en el centro. Esto facilita la detección temprana de las raíces jóvenes, así como de las hifas. También permite la detección de hifas o esporas de especies que prefieren la proximidad de las raíces.
Coloque unos 15 g de polímero en el compartimento opuesto. El polímero debe entrar bien en contacto con la membrana de Nitex para facilitar el paso del hongo hacia el compartimento de polímero.
Coloque la tapa y séllela con una cinta de parafilm para mantener la tapa en su sitio. Tenga cuidado de no “guillotinar” la plántula. Pese la caga, ya que el peso servirá como referencia para el riego.
Montaje con plántulas muy pequeñas:
Algunas plantas, como Fragaria vesca o Plantago coronopus, tienen plántulas tan diminutas que no se pueden colocar en el fondo de la placa de Petri. En estos casos, las plántulas se depositan sobre la vermiculita bien humedecida y, con mucho cuidado, se colocan de nuevo algunos granos de vermiculita sobre las raíces para asegurarles un microambiente húmedo. No hay que dudar en trabajar bajo el estereomicroscopio para estas operaciones.
Reubicar plántulas:
A veces sucede que una plántula joven se desarrolla en el lugar equivocado, debajo de la tapa; no hay que dudar en abrir la tapa y reubicarla con cuidado.
Guía de planificación paso a paso
- Materiales
- Guantes
- Protección para los oídos y los ojos, especialmente contra la luz ultravioleta si es necesario
- Opcional: campana extractora para las escasas emanaciones de humo
- Placas de Petri bicompartimentadas
- Membrana de Nitex con mallas de 30 µm o menos
- Rotulador y alcohol para limpiar
- Regla milimetrada
- Guías de corte/soldadura de metal
- Herramienta de pirograbado y puntas adecuadas (al menos una)
- Herramienta rotativa y brocas adecuadas (probablemente tres)
- Tijeras (para la membrana de Nitex)
- Pequeño raspador de metal
- Pegamento que cura con luz ultravioleta
- Lámpara ultravioleta y protección adecuada
- Lupa binocular (para verificar el trabajo final)
- Plantilla
- Aspiradora o chorro de aire (para limpiar el polvo y los restos de corte de las placas de Petri)
- Cortar las tapas
- Perforar los agujeros de la parte superior de la tapa, así como la abertura lateral, con la herramienta rotativa ( ilustrado aquí) y la misma broca. Esta operación se puede hacer sin plantilla. Alinear bien en línea recta las tres aberturas.
- Cortar la abertura lateral de la placa de Petri. Sin cambiar la broca utilizada para las tapas, cortar todas las aberturas. Las aberturas laterales quedan frente a la barrera central.
- Marcar con rotulador las dimensiones para las aberturas centrales
- Marcar con rotulador las dimensiones para la abertura redonda si se desea pegar cubreobjetos para alta definición. La abertura redonda siempre está del lado del polímero (opuesto a la abertura) y generalmente en diagonal respecto a la abertura de la tapa, para no regar directamente encima del cubreobjetos. La abertura redonda se marca DEBAJO de la placa de Petri, para poder borrarla después.
- Con la herramienta rotativa, cortar las aberturas en la barrera central.
- Con la herramienta rotativa, cortar la abertura redonda en el fondo de la placa de Petri.
- Generalmente, se ahonda en las líneas de manera que no haya que borrarlas. Si es necesario, se pueden borrar las marcas restantes con alcohol.
- Con un pequeño raspador, limpiar y eliminar todas las asperezas de plástico fusionado que puedan dificultar la colocación de la membrana de Nitex o del cubreobjetos. Esto es especialmente importante para los cubreobjetos que se pegarán debajo de la placa de Petri.
- Utilizar un chorro de aire para limpiar bien las placas de Petri.
- Cortar los trozos de membrana de Nitex con tijeras u otra herramienta.
- Hacer un pliegue en la membrana (opcional), como se muestra aquí, para facilitar su colocación, sobre todo si se usa pegamento.
- Opción 1) Fijar la membrana de Nitex con calor, como se muestra más arriba.
- Opción 2) Fijar las membranas con pegamento ultravioleta, como se muestra más arriba. Tenga en cuenta que la longitud de onda ultravioleta para los pegamentos suele ser diferente de las longitudes de onda utilizadas para esterilizar material. Por ello, se necesita una luz específica adaptada al pegamento utilizado.
- Pegar los cubreobjetos debajo de la placa de Petri para observación en alta definición, como se muestra más arriba. Los cubreobjetos deben pegarse debajo de la placa de Petri para poder limpiarlos. Esta operación se realiza idealmente en varias etapas pequeñas:
- Se ha perforado el agujero
- Colocar el pegamento UV a lo largo del agujero formando un círculo cerrado.
- Colocar el cubreobjetos sobre el pegamento, asegurándose de que todo quede perfectamente sellado. Utilizar unas pinzas para lograr una colocación limpia y sin rebabas.
- Curar el pegamento con la lámpara ultravioleta, protegiendo la piel y los ojos según las instrucciones.
- Dar la vuelta a la placa de Petri y aplicar un cordón fino de pegamento a lo largo de la junta para no dejar ninguna microabertura por donde una raíz pueda introducirse entre el cubreobjetos y la placa de Petri, lo que haría que la raíz creciera y despegara el cubreobjetos. Curar de nuevo con luz UV este último cordón de pegamento.
Enlaces a las publicaciones oficiales
El siguiente enlace lleva directamente al vídeo de fabricación de una placa de Petri con el método de pirograbado.
https://www.jove.com/v/66848/author-spotlight-enhancing-am-fungi-research-with-sap-as-novel