Filmar la circulación en las hifas
La mayoría de los videos de esta página están en alta definición para ofrecerte la mejor percepción posible de los resultados obtenidos con las técnicas descritas. Por lo tanto, son archivos grandes que tardan en cargar. Ten paciencia y utiliza, en la medida de lo posible, la reproducción a pantalla completa: las imágenes valen la pena.
La circulación de los organelos dentro de las hifas es uno de los fenómenos más fascinantes de observar. Hasta la fecha, no se sabe con certeza cómo los organelos circulan simultáneamente en ambos sentidos dentro de un mismo conducto (hifa cenocítica). La observación de hifas vivas es, por lo tanto, indispensable para avanzar hacia una respuesta. Prácticamente todas las imágenes que siguen fueron obtenidas en placas de Petri con Plantago lanceolata y Rhizophagus irregularis.
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Regla general:
Las observaciones se realizan con placas de Petri que contienen una planta hospedera y un hongo activo, mirando a través del fondo del recipiente, donde las hifas se depositan de forma natural por geotropismo. Con el microscopio derecho y con la lupa binocular, basta con voltear la placa de Petri, cuidando que no se derrame líquido sobre la platina; generalmente se sellan las aberturas con cinta adhesiva.
Las mejores imágenes se obtienen cuando las hifas se encuentran entre un grano de polímero y el plástico o vidrio del fondo de la placa de Petri, ya que estos materiales tienen índices de refracción similares.
Con la lupa binocular + cámara EP50
Con la lupa binocular, lo mejor que se puede esperar es detectar movimiento en algunas hifas. El siguiente video muestra el mejor resultado obtenido con la lupa binocular Olympus SZ61 y la cámara Olympus EP50, cuyo zoom manual cubre un rango de 6.7× a 45×.
Basta con colocar la placa de Petri boca abajo sobre la platina, y luego observar y filmar.
En este video se seleccionó una hifa de interés y el zoom se aumentó gradualmente de 6.7× a 45×, con ajuste manual del enfoque, lo que explica algunas imperfecciones. Primero se observan algunas hifas a través del fondo de la placa de Petri, justo debajo del polímero, donde la calidad de imagen es óptima. Al aumentar el aumento, los movimientos dentro de las hifas se vuelven perceptibles. El video se reproduce en tiempo real: el citoplasma efectivamente circula a esta velocidad dentro de las hifas.
Esto es lo que se puede observar al aumentar gradualmente el zoom.
Con el microscopio invertido
El microscopio invertido es particularmente sencillo de usar: basta con colocar la placa de Petri normalmente sobre la platina.
Este tipo de microscopio está diseñado para observar a través del fondo de los recipientes, incluidas las placas de Petri. Para ello, los objetivos de alto aumento deben tener una distancia de trabajo grande, lo que implica una apertura numérica (NA) más baja y, en consecuencia, una resolución reducida. Aun así, es posible realizar excelentes observaciones, en particular de los movimientos dentro de las hifas o las esporas.
La observación comienza con un objetivo de 4× para localizar una zona donde las hifas estén bien pegadas al fondo de la placa de Petri. Es útil identificar previamente estas zonas con la lupa binocular y marcarlas con lápiz. A través del ocular, los movimientos se distinguen fácilmente. El siguiente video muestra que, al aplicar un zoom digital de 5×, la circulación dentro de las hifas se vuelve claramente visible.
Lente 40X
Esto es lo que se puede filmar directamente utilizando una lente Olympus LCAch N 40X NA=0.55 PhP UIS2.
Utilizando la proyección en pantalla y el zoom digital, se puede obtener un poco más de detalle:
Con el microscopio derecho
Esta sección presenta las imágenes que se pueden obtener al preparar la placa de Petri con un cubreobjetos de 0.17 mm para imágenes de alta definición. La placa de Petri debe voltearse después de sellar temporalmente las aberturas para evitar ensuciar la platina. Cabe señalar que se agregó un pequeño soporte de pasador a la pinza de sujeción para permitir manipular la placa de Petri con el carro mecánico.
El primer paso consiste en seleccionar una zona de interés con el objetivo 10× bajo el cubreobjetos. Sin embargo, un enfoque nítido a 10X no garantiza una observación satisfactoria a 40X o 100X, debido a las distancias de trabajo más cortas de los objetivos de alto aumento. Por lo tanto, es indispensable localizar segmentos de hifas muy cercanos al cubreobjetos para poder usar el objetivo 100×. El zoom digital en pantalla facilita esta evaluación, aunque el ocular funciona igual de bien.
Lente 40X
Al cambiar al objetivo 40X (Olympus Plan C N UIS2 40X/0.65 Ph2) en esa misma zona, se observa que el cubreobjetos de 0.17 mm no es indispensable a este aumento: las estructuras suficientemente cercanas al fondo siguen siendo observables directamente a través del plástico.
La proyección en pantalla y el zoom digital también son útiles aquí:
La resolución obtenida con el objetivo 40X del microscopio derecho es notablemente superior a la del microscopio invertido. Esta diferencia se explica por la mayor apertura numérica y por el uso de un cubreobjetos en lugar de plástico como medio atravesado.
Lente 100X
El objetivo 100X (NA = 1,25) con aceite de inmersión también ofrece resultados interesantes. Dado que el plástico de la placa de Petri es demasiado grueso para permitir el enfoque a este aumento, se pegó precisamente un cubreobjetos de 0,17 mm en el exterior de la placa de Petri, sobre el cual se aplica el aceite de inmersión. Los siguientes videos se obtuvieron ya sea por filmación directa o por grabación de pantalla con zoom digital. Se observa la presencia de algunos protistas, pasajeros clandestinos de la placa de Petri, así como una ligera aberración cromática hacia el verde en las hifas, debida a la corrección imperfecta de esta longitud de onda por parte del objetivo.
El zoom digital también se puede aumentar aún más, como lo muestra el siguiente video de grabación de pantalla con zoom de 5× y 10×. A 10×, la imagen se vuelve borrosa, lo cual es de esperarse: se alcanza el límite de resolución del objetivo.
Esta página concluye con dos videos adicionales realizados con estas técnicas. En ellos se observan pequeñas esferas azuladas de aspecto extraño, probablemente lípidos, arrastradas por fuertes corrientes citoplasmáticas continuas. Se recomienda la visualización a pantalla completa.