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Tinta y vinagre
La técnica desarrollada por Vierheilig — Ink and Vinegar, a Simple Staining Technique for Arbuscular-Mycorrhizal Fungi — presenta la ventaja de no requerir productos químicos cancerígenos. La versión utilizada aquí es una adaptación simplificada de este método:
- Preparar la solución de KOH al 10% (peso/volumen) tal como se describe en el método. Para simplificar, si se disuelven 10 g de KOH en 100 ml de agua, esta solución funcionará muy bien. Añadir siempre el KOH seco gradualmente al líquido, nunca al revés.
- Preparar la tinta negra Sheaffer no. 94231: 5 ml de tinta en 95 ml de vinagre al 5%. El vinagre de supermercado al 5% funciona bien.
- Colocar las raíces durante 3 minutos en la solución de KOH previamente calentada entre 90 °C y 100 °C, enjuagar unos minutos en un vaso de precipitados con agua del grifo
- Colocar las raíces durante 3 minutos en la solución de tinta-vinagre previamente calentada entre 90 °C y 100 °C, enjuagar unos minutos en un vaso de precipitados con agua del grifo.
- Luego, está listo para la observación. A veces es preferible dejar decolorar hasta el día siguiente, pero en general, se pueden realizar excelentes observaciones inmediatamente después del enjuague.
Detallo en este enlace un truco para colorear pequeños volúmenes de raíces.
Aquí hay información adicional sobre el método:
- Los tiempos de tratamiento en las soluciones de KOH y vinagre varían según el grosor de las raíces, su contenido de celulosa, las especies de plantas, etc. Hay que hacer pruebas caso por caso. Los tiempos descritos aquí funcionan bien para Plantago lanceolata. Otras plantas podrían requerir más tiempo.
- Para ahorrar tiempo, utilizo el microondas para elevar la temperatura de las soluciones hasta 90 °C y luego coloco el vaso de precipitados sobre la placa calefactora para poder controlar mejor la ebullición y agitar la solución.
- De manera inexplicada, esta técnica no parece colorear el hongo Diversispora varaderana.
Aquí hay algunas fotos de los resultados
Sobre el polímero superabsorbente en el KOH y el vinagre:
Hasta la fecha, he puesto a menudo granos de polímero en el KOH y luego en el vinagre hirviendo sin observar degradación o descomposición del polímero. APARENTEMENTE, el polímero parece inerte y no reacciona químicamente, aunque se contrae un poco. La tinta penetra en los granos y vuelve a salir cuando se colocan en agua. Se necesitarían estudios químicos precisos para garantizar la total inocuidad del polímero en estas condiciones, pero no tengo conocimiento de que esto se haya hecho. Por lo tanto, no hay certeza absoluta sobre las reacciones o ausencia de reacciones del polímero en este proceso. Actúe con prudencia según las buenas prácticas de laboratorio. En caso de duda, no dude en trabajar bajo una campana química.
Azul de metileno en raíces e hifas vivas
Se trata de una simple prueba “para ver”. En una placa de Petri que contiene P. lanceolata y R. irregularis, con el polímero en suspensión fina (ver aquí cómo fabricarlo), deposité una gota de azul de metileno (solución acuosa al 1%) para ver el efecto colorante. El colorante afecta rápidamente todo el material que toca y luego se difunde lentamente en el polímero. Los efectos observados son:
- 1) Las raíces se colorean ligeramente de azul pálido
- 2) Algunas células de las raíces (¿muertas?) están fuertemente coloreadas según un “patrón” regular.
- 3) Parece que el colorante es transportado desde el interior por las raíces, ya que se ven raíces coloreadas lejos de la zona de difusión en el polímero
- 3) Algunas esporas, pero en baja proporción, están coloreadas, probablemente porque están muertas, ya que ya no detecto ningún movimiento en las hifas suspensoras. Las esporas coloreadas se encuentran donde cayó la gota.
- 4) Las hifas extraradicales no están coloreadas
- 5) Ni las hifas intraradicales ni las vesículas están coloreadas
En conclusión, el azul de metileno no nos revela gran cosa sobre el hongo. Sin embargo, el patrón de células muertas en las raíces es intrigante. ¿Tiene el hongo un papel en la muerte de estas células?
hifas extraradicales no están coloreadas y no se observa ninguna hifa intraradical..
Tinta Sheaffer en raíces e hifas vivas
Se trata de una simple prueba “para ver”. En una placa de Petri que contiene P. lancolata y R. irregularis, con el polímero en suspensión fina (ver aquí cómo fabricarlo), deposité una gota de tinta negra Sheaffer 94231 pura (sin dilución) para ver el efecto colorante. El colorante afecta rápidamente todo el material que toca y luego se difunde lentamente, durante varios días, en el polímero.
La coloración alcanza todas las esporas, pero no coloreó las hifas suspensoras. Parece que las hifas “runner” transportaron el colorante hacia el interior de las esporas más alejadas, y que el colorante se acumula allí de manera que se vuelve perceptible.
Los efectos observados son:
- 1) Tras depositar la gota, se forma una mancha negra en pocos segundos y se difunde poco
- 2) La tinta se difunde lentamente, durante varios días
- 3) Las esporas se colorean de negro al cabo de unos días, incluso aquellas que parecen alejadas del polímero aún teñido
- 4) Las hifas suspensoras y las hifas pequeñas no parecen colorearse, o muy poco.
- 5) Algunas hifas, especialmente las “runner”, parecen colorearse de forma oscura. Estas hifas presentan una circulación activa a pesar de la coloración.
- 6) Ninguna estructura intraradical parece estar coloreada ni revelada
Conclusión: La tinta utilizada de manera pura no parece aportar mucha información nueva. Sin embargo, la coloración de las hifas “runner” sugiere que las hifas transportan el colorante para llevarlo al interior de las esporas.
