Este gránulo de polímero que contiene numerosas esporas constituye un excelente inóculo
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- Prueba de germinación de esporas
- Método con raíces colonizadas
- Método con esporas a granel en suspensión líquida
- Método de inoculación con gránulos de polímero “colonizados”
- Método de inoculación monosporal
- Método estilo “trap culture” próximamente
- Método con inóculo comercial próximamente
Prueba de germinación de esporas
Puede resultar útil verificar la tasa de germinación de las esporas antes de utilizarlas. Las esporas no esterilizadas portan en su superficie numerosos contaminantes — bacterias, microhongos, etc. — que complican el uso de protocolos diseñados para material estéril. La suspensión de microparticulas de polímero resulta poco sensible a los contaminantes y permite así realizar las pruebas de germinación con las esporas acompañadas de su cortejo bacteriano natural.
El método consiste en depositar cerca de 2 ml (o 2 g) de suspensión de microparticulas de polímero en cada pozo. Es importante preparar la suspensión con una solución nutritiva, ya que los ensayos realizados con agua pura generalmente no germinan. Aunque los pozos pueden contener hasta 5 ml, conviene limitarse a 2 ml, de manera que las hifas se desarrollen sobre todo horizontalmente y no en profundidad — este volumen también facilita la toma de fotografías.
Una vez depositado el polímero, colocar una espora única en el centro del pozo. La viscosidad del polímero mantiene la espora bien visible en posición central, lo que permite detectar fácilmente el crecimiento de las hifas bajo el estereomicroscopio.
Después de depositar las esporas, colocar la tapa para limitar los riesgos de contaminación y dejar reposar en la oscuridad. Las primeras esporas viables pueden presentar hifas después de algunos días. Sin embargo, el plazo de germinación no responde a ninguna regla precisa: puede variar de algunos días a varias semanas según la especie, la temperatura o una eventual latencia.
El éxito de la germinación indica que las esporas están vivas y probablemente aptas para un uso experimental. La ausencia de germinación no indica necesariamente que las esporas estén muertas, pero sí sugiere condiciones que deben validarse.
Una espora germinada en el polímero no es por ello una espora « perdida » o « desperdiciada ». Es posible recolectarla con cuidado, junto con sus hifas, para depositarla sobre una raíz — una manipulación delicada que se explicará e ilustrará más adelante.
Método con raíces colonizadas
Este método consiste simplemente en cortar trozos o bloques de raíces sin separarlos de la vermiculita a la que están adheridos, y colocarlos en la placa de Petri de destino para facilitar la colonización por el hongo. Se presume que los bloques contienen hifas, esporas y otras estructuras según la especie, y que además las raíces colonizadas pueden contener hifas, vesículas y otras estructuras. El conjunto favorece un contacto rápido con las raíces receptoras y el establecimiento de la simbiosis.
El proceso comienza con la selección de una placa de Petri fuente cuya colonización se ha confirmado con el estereomicroscopio o mediante muestreo. Se utilizan tijeras y pinzas limpias.
Extraer la red de raíces entrelazadas que forma una especie de tejido grueso. Cortar tiras de aproximadamente 1 a 1,5 cm de ancho con las tijeras. No intentar separar la vermiculita.
La placa de Petri de destino contiene una plántula de 2 a 3 semanas cuyas raíces llegan al centro de la placa. Es sobre estas raíces que se depositará el inóculo.
Colocar un trozo de raíces directamente sobre las raíces receptoras y presionar suavemente para asegurar un buen contacto.
Sellar la placa Petri, identificar claramente la zona de inoculación para referencia futura, y devolverla al cultivo normal.
Variante del método de las raíces:
Usar un simple segmento de raíz en lugar de un bloque “raíz/vermiculita”. Este procedimiento funciona bien con Rhizophagus irregularis, que produce numerosas vesículas y esporas dentro de las raíces. Los resultados probablemente sean variables con otras especies.
Método con esporas a granel en suspensión líquida
Este ejemplo utiliza esporas de Gigaspora rosea extraídas por tamizado desde una placa de Petri que contiene vermiculita y polímero. La suspensión contiene micro-trozos residuales de vermiculita mezclados con las esporas. No se utiliza azúcar, producto químico ni esterilizante. El proceso comprende las siguientes etapas:
- Preparar las herramientas
- Validar la densidad de esporas en la solución
- Despejar el sitio de inoculación
- Depositar las esporas
- Cerrar la placa de Petri y devolverla al cultivo
El proceso comienza con una plántula receptora de 2 a 3 semanas cuyas raíces son bien visibles bajo el polímero. El montaje inicial de la placa de Petri se explica aquí.
La suspensión se agita para obtener una densidad de esporas homogénea antes de la recolección con la pipeta. Esta muestra contiene trozos de vermiculita mezclados con las esporas.
Se utiliza una pipeta para manipular las esporas. Como las esporas de G. rosea están mezcladas con micro-trozos de vermiculita que podrían obstruir la punta, el extremo se cortó para obtener una abertura de aproximadamente 1500 µm.
La validación consiste en tomar 0,5 ml de suspensión y examinarla con la lupa binocular. En este ejemplo, se observaron aproximadamente 30 esporas en 0,5 ml — una densidad considerada adecuada de forma empírica. Como la tasa de germinación, la viabilidad y el grado de madurez de las esporas son desconocidos, esta elección sigue siendo arbitraria. Cada operador determinará la densidad que le convenga según las especies y el protocolo del experimento o del cultivo.
Trabajando con la lupa binocular, identificar un sitio donde se distingan raíces despejadas y depositar allí el inóculo (0,5 ml en este ejemplo) delicadamente sobre las raíces.
Tras el depósito de las esporas, solo queda sellar la placa de Petri y devolverla al cultivo.
Método con gránulos de polímero colonizados
Los gránulos de polímero que contienen esporas constituyen un excelente inóculo. Son posibles dos protocolos:
Uso inmediato en estado fresco: Se extrae un gránulo colonizado de una placa Petri donante activa y se coloca inmediatamente en la placa receptora sobre una raíz. Parece que el hongo, privado de su huésped, busca reconectarse rápidamente con un huésped, y la simbiosis generalmente se restablece muy rápido.
Uso diferido: Los gránulos se extraen y se conservan en el refrigerador (4 °C) o en el congelador (-16 °C). La duración de supervivencia de las esporas en estas condiciones no está establecida con certeza. Ensayos preliminares sugieren que una conservación de menos de 3 meses en el refrigerador preserva una buena capacidad de reinicio — un tema que merece investigación formal. Rhizophagus irregularis sobrevivió bien a episodios de congelación.
Importante: No todas las especies producen sus esporas dentro de los gránulos de polímero. Este método, por lo tanto, no se aplica a todas las especies.
Los gránulos colonizados deben manipularse con delicadeza:
El polímero hidratado es blando y muy elástico — mucho más que las hifas que contiene. Una presión excesiva puede romper las hifas sin afectar al gránulo. Los gránulos nunca se cortan por la mitad y siempre se manipulan con delicadeza. Las pinzas curvas descritas aquí son particularmente adecuadas para estas manipulaciones. Se prefieren los gránulos con más de 25 esporas.
Inspección de gránulos colonizados en una placa de Petri bajo el estereomicroscopio, tras una estancia en tubo en el refrigerador; entre 10 y 15 gránulos + un poco de líquido
Vista con el estereomicroscopio de los paquetes de gránulos colonizados depositados en la placa de Petri.
Gránulo muy bien colonizado a gran aumento; los gránulos menos densos también son utilizables
Plántula receptora, de 2 a 3 semanas, raíces visibles bajo el polímero. El montaje de la placa de Petri se describe aquí.
Bajo el estereomicroscopio, identificar en la placa de Petri receptora un sitio donde las raíces estén bien despejadas.
Si es necesario, desplazar un poco de vermiculita o polímero para exponer algunas raíces. El gránulo debe poder tocar la raíz sin que se necesite una fuerte presión.
gránulo depositado (flecha roja) con esporas visibles en su interior
Después del depósito, cerrar la placa de Petri y devolverla al cultivo normal.
Método de inoculación monosporal.
Es el método más delicado, y también el más importante: permite obtener cultivos puros, en los que todas las esporas son genéticamente idénticas. Es moderadamente eficaz por naturaleza, ya que el éxito depende de una sola espora cuya viabilidad no está garantizada. Con esporas de buena calidad, se puede alcanzar una tasa de éxito de 75 a 80 % en ciertas especies.
Trabajo en medio abierto: Limpio pero no estéril
Las manipulaciones pueden realizarse sin esterilidad, en sistema abierto. Sin embargo, las herramientas se limpian o esterilizan con llama o alcohol, pero el trabajo se realiza al aire libre.
Conservar las bacterias de la esporosfera
Las esporas provenientes de un cultivo en maceta van acompañadas de sus bacterias asociadas. La literatura sugiere que varias especies podrían necesitarlas. Por eso se evitan los antibióticos, para preservar este microbiota.
El equipo necesario:
El equipo necesario es relativamente modesto. Un estereomicroscopio, unas pinzas curvas y una micropipeta son suficientes.
La secuencia de las operaciones se describe a continuación:
- Colocar el inóculo en solución para facilitar la recolección
- Despejar una raíz receptora
- Extraer la espora única
- Depositar la espora sobre la raíz
- Cerrar la placa de Petri y poner en cultivo.
1. Colocar el inóculo para facilitar la recolección
Las esporas pequeñas son frágiles y son más fáciles de manipular cuando están en medio líquido. Se coloca una pequeña cantidad de líquido y esporas en un recipiente abierto colocado bajo el estereomicroscopio. La presencia de restos vegetales o minerales generalmente no representa un problema.
Un vidrio de reloj estabilizado sobre un trozo de parafina bajo el estereomicroscopio funciona muy bien. Una placa de Petri común también funciona.
2. Despejar una raíz receptora
Bajo el estereomicroscopio, identificar una raíz receptora y despejar el espacio de trabajo a su alrededor. Se prefiere una raíz situada bajo el polímero pero del lado de la plántula: esto permitirá detectar más fácilmente la actividad del hongo más adelante.
3. Extraer la espora única
Esta operación se realiza manualmente con la micropipeta. Mirando por el estereomicroscopio, elegir una buena espora y aspirarla con la micropipeta presionando/descomprimiendo suavemente la perilla. Luego se depositará sobre la raíz elegida.
Utilizo ambas manos para estabilizar la pipeta bajo el estereomicroscopio. La pequeña perilla está bajo mi pulgar derecho (oculto por el tubo negro). Se puede seleccionar y aspirar una sola espora con un movimiento de presión-descompresión muy ligero sobre la perilla.
Una sola espora aislada y aspirada tras algunos intentos. Retirar entonces delicadamente la pipeta del líquido
Gracias a la capilaridad, la espora permanece en la punta de la micropipeta, incluso al soltar la perilla fuera del líquido. Así se puede avanzar con calma hacia la raíz del receptor.
4. Depositar la espora sobre la raíz
Siempre bajo el estereomicroscopio, acercar la pipeta a la raíz receptora. La flecha roja indica el destino elegido. Presionar suavemente la perilla para liberar la espora, sin lastimar la raíz.
La espora está en contacto estrecho con la raíz.
5. Cerrar la placa de Petri, asegurar el contacto y devolverla al cultivo.
Para que la colonización se establezca, la espora y la raíz deben intercambiar señales químicas en un microambiente húmedo. Cubrir delicadamente la raíz y la espora con polímero y/o vermiculita para mantenerlas en un microambiente húmedo evitando desplazar la espora. Hay que evitar tanto la desecación como un riego demasiado rápido que arrastraría la espora lejos de la raíz. Esperar al menos 24 horas antes del primer riego.