La photographie des arbuscules est probablement un des défis les plus difficile en photographie mycologique. Le premier défi est de les trouver. Le deuxième est de réussir la préparation d’une lame pour une image qui soit au moins probante et idéalement de qualité « publication ». Nous allons décrire et illustrer avec tous les détails ces méthodes sur cette page, avec Rhizophagus irregularis et la plante hôte Plantago lanceolata
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- Outils et instrumentation requis
- Préparation et coloration
- Sélection et examen des racines
- Montage final
- Photographie
Outils et instrumentation
- Loupe binoculaire et microscope droit avec objectif au moins 40X
- Micro-outils: Mini-ciseaux, micro-aiguilles et fines pincettes
- Caméra, évidemment.
- Lame, lamelles et milieux de montages
- Racines colonisées et colorées J’utilise ici surtout la méthode encre et vinaigre
Préparation et coloration
Extraction des racines colonisées
Disposant d’un pétri bien colonisé, j’extraie l’ensemble du réseau racinaire qui a traversé du coté polymère. Je sais que les racines sont assez jeunes, donc il s’agit d’un bon potentiel pour y trouver des arbuscules. On peut aussi voir sous la loupe binoculaire que plusieurs racines sont déjà bien « colonisées » car on aperçoit aisément des vésicules dans les racines. Notez que je n’ai jamais réussi à apercevoir ou identifier des arbuscules dans une racine vivante malgré de nombreuses observations et recherches.
Le processus débute avec un pétri contenant des racines bien colonisées. Les spores sont souvent visible à la loupe binoculaire.
Dans cet illustration, j’ai choisi d’échantillonner l’ensemble des racines qui sont dans le polymère. On pourrait aussi sélectionner des racines dans la vermiculite. La plante supporte aisément ces coupures de racines.
Voici donc le paquet de racines qui sera soumis au processus de coloration, sans retirer le polymère. Le paquet de racines sera baigné dans le KOH , rincé et ensuite soumis à l’encre et vinaigre.
Sous la loupe binoculaire, on vérifie aussi que les racines sont bien colonisées. On y distingue de nombreuses vésicules, donc potentiellement elles contiennent aussi des arbuscules.
Coloration
Il faut ensuite colorer les hyphes pour les distinguer. J’utilise la méthode « Encre et vinaigre » qui est décrite dans la page indiquée par ce lien.
Sélection et examen des racines
Après la coloration, on doit sélectionner les racines qui présentent le meilleur potentiel photographique. On doit distinguer les vésicules des arbuscules. Rhizophagus irregularis produit de grosses vésicules à l’intérieur des racines. Les vésicules se colorent très bien, bleu foncé, presque noir. Les arbuscules sont beaucoup moins contrastés et généralement présentent un bleu moyen peu intense. C’est donc ce qu’on doit rechercher sous la loupe binoculaire.
Généralement lorsqu’il y a abondance de vésicules, il y peu ou pas d’arbuscules dans le même segment. De plus, l’abondance des vésicules fait obstacle pour bien voir les arbuscules. La photo qui suit illustre trois racines avec différents potentiel photographique. Seule la racine indiquée par une flèche verte représente une bonne candidate pour la photographie des arbuscules.
L’étape suivante se déroule sous le microscope droit, avec un objectif 10X.
Que faire si on ne trouve pas d’arbuscules: on recommence avec d’autres segment de racines. Selon les espèces et le degré de colonisation, les arbuscules peuvent être facile à trouver ou au contraire très difficile à trouver.
De retour sous la loupe binoculaire l’étape suivante consiste à faire un « effeuillage » de la racine. Cela consiste à la déchirer en feuillets qui auront, pour la plupart une épaisseur d’une seule couche de cellules. Les arbuscules inclus dans ce feuillet pourront être photographiés avec une très belle qualité photographique.
On doit alors retirer délicatement la lamelle et laisser uniquement le segment de racine prometteur sur la lame. Puisque le montage temporaire s’est fait avec de l’eau, cette opération est assez facile.
On doit ensuite remettre une goutte d’eau sur la lame, sur le segment de racine. Les manipulation suivantes s’exécutent à l’intérieur de la goutte d’eau, sous la loupe binoculaire.
À l’aide des pincettes fines des micro-aiguilles (aiguilles d’acupuncture préférablement), sous la loupe binoculaire, réaliser l’effeuillage de la racine.
Montage final
Après avoir effeuillé la racine, on peut « éponger » l’excès d’eau en préparation pour la montage final. On peut aussi utiliser les aiguilles pour étendre les feuillets et s’assurer de leur disposition optimale. La lame avec les feuillets de racines devrait avoir environ cette apparence (avant d’y déposer une lamelle).
À ce stade, trois options de montage sont envisageable:
- Déposer une goutte d’eau, mettre la lamelle et photographier. Les cellules sont encore gorgées d’eau et les arbuscules sont probablement dans une conformation proche de l’original. Toutefois la photographie exigera de faire plusieurs photos à différentes profondeur de champ. Évidemment, les échantillons ne se conserveront pas.
- Laisser sécher pour faire pour ensuite faire un montage avec un milieu de montage approprié tel que le PVLG (PolyVinyl-lacto-glycol). Il s’agit de ma méthode préférée. Les contrastes sur les montages faits avec le PVLG semblent s’améliorer au bout de quelques jours (selon mon œil amateur), mais on peut faire d’excellentes photos sans attendre.
- Laisser sécher et faire un montage avec une colle transparente qui durcit à l’ultraviolet. J’ai expérimenté ces montages avec satisfaction. L’intérêt principale est que la lamelle est définitivement fixée en quelques secondes, ce qui nous permet d’utiliser l’huile à immersion pour des images 100X immédiatement.
Photographie:
On place la lame sous le microscope et on cherche « à tâtons » les arbuscules les plus beaux et les mieux placés. Il peut arriver qu’aucun arbuscule ne soit bien placé ou qu’ils ne soient pas photogéniques. On doit alors simplement recommencer le processus. Ici l’échantillon a produit de beaux arbuscules.
Voilà donc quelques arbuscules photographiés depuis la lame ci-haut avec un objectif 40X et un recadrage sur la section pertinente de la photo .
Même échantillon, mais sur une autre racine…
présente qu’une masse cubique bien peu spectaculaire. Celui du bas montre des branches qui illustrent mieux le concept d’arbuscule.
