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- Encre et vinaigre
- Bleu de méthylène sur racines et hyphes vivants
- Encre Sheaffer sur racines et hyphes vivants
Encre et vinaigre
La technique développée par Vierheilig — Ink and Vinegar, a Simple Staining Technique for Arbuscular-Mycorrhizal Fungi — présente l’avantage de ne recourir à des produit chimique cancérigène. La version utilisée ici est une adaptation simplifiée de cette méthode :
- Préparer la solution de KOH 10 % (wt/vol) tel que décrit dans la méthode. Pour faire simple, si on dépose 10 gr de KOH dans 100 ml d’eau, cette solution fonctionnera très bien. Toujours mettre graduellement le KOH sec dans le liquide, jamais l’inverse.
- Préparer l’encre Sheaffer noire no 94231 : 5 ml d’encre dans 95 ml de vinaigre 5%. Le vinaigre d’épicerie à 5% convient bien.
- Mettre les racines 3 minutes dans la solution de KOH préalablement chauffée entre 90 °C et 100°C, rincer quelques minutes dans un bécher avec l’eau du robinet
- Mettre les racines 3 minutes dans la solution d’encre-vinaigre préalablement chauffée à 90 °C et 100°C, rincer quelques minutes dans un bécher avec l’eau du robinet.
- Ensuite, c’est prêt pour l’observation. Quelquefois il est souhaitable de laisser décolorer jusqu’au lendemain, mais en général, on peut réaliser d’excellente observations immédiatement après le rinçage.
Je détaille sur ce lien un truc pour colorer de petits volumes de racines.
Voici quelques compléments d’information sur la méthode:
- Les temps de traitement dans les solutions, KOH et vinaigre varient en fonction de l’épaisseur des racines, de leur teneur en cellulose, des espèces de plantes, etc. Il faut faire des essais au cas par cas. Les temps décrits ici fonctionnent bien pour Plantago lanceolata. D’autres plantes pourraient requérir plus de temps.
- Pour gagner du temps, j’utilise le micro-ondes pour élever la température des solutions jusqu’à 90°C et ensuite je dépose le bécher sur la plaque chauffante afin de pouvoir mieux contrôler le bouillonnement et agiter la solution.
- De manière inexpliquée, cette technique ne semble pas colorer le champignon Diversispora varaderana.
Voici quelques photos des résultats
Concernant le polymère superabsorbant dans le KOH et le vinaigre:
À ce jour j’ai souvent mis des grains de polymère dans le KOH et ensuite dans le vinaigre bouillonnant sans observer de dégradation ou décomposition du polymère. EN APPARENCE, le polymère semble inerte et ne pas réagir chimiquement, bien qu’il se contracte un peu. L’encre pénètre dans les grains et en ressort lorsqu’on les mets dans l’eau. Il faudrait des travaux précis de chimie pour garantir la parfaite innocuité du polymère dans ces condition, mais je n’ai pas connaissance que cela aie été fait. Il n’y a donc pas de certitude absolue sur les réactions ou absence de réactions du polymère dans ce procédé. Agissez donc prudemment selon les bonnes pratiques de laboratoire. En cas de doute, n’hésitez pas à travailler sous une hotte chimique.
Bleu de méthylène sur racines et hyphes vivants
Il s’agit d’un simple test « pour voir ». Dans une boîte de Petri contenant P. lanceolata et R. irregularis, avec le polymère en fine suspension (voir ici comment le fabriquer), j’ai déposé une goutte de Bleu de méthylène (solution aqueuse 1%) afin de voir l’effet colorant. Le colorant affecte rapidement tout le matériel touché et ensuite diffuse lentement dans le polymère. Les effets observés sont:
- 1) Les racines sont colorées légèrement en bleu pâle
- 2) Certaines cellules des racines (morte ?) sont colorées fortement selon un « motif » régulier.
- 3) Il semble que le colorant soit transporté de l’intérieur par les racines car on voit des racines colorées loin de la zone de diffusion dans le polymère
- 3) Certaines spores, mais en faible,proportion, sont colorées, vraisemblablement elles sont mortes car je ne détecte plus aucun mouvement dans les hyphes suspenseurs. Les spores colorées sont positionnées là ou la goutte est tombée.
- 4) Les hyphes extraracinaires ne sont pas colorés
- 5) Ni les hyphes intraracinaires ni les vésicules ne sont colorés
En conclusion, le bleu de méthylène ne nous révèle pas grand chose sur le champignon. Toutefois,le patron de cellules mortes sur les racines est intriguant. Est-ce que le champignon a un rôle dans la mort de ces cellules ?
hyphes extraracinaires ne sont pas colorées et aucun hyphe intraracinaire n’est visible..
Encre Sheaffer sur racines et hyphes vivantes
Il s’agit d’un simple test « pour voir ». Dans une boîte de Petri contenant P. lancolata et R. irregularis, avec le polymère en fine suspension (voir ici comment le fabriquer), j’ai déposé une goutte d’encre noire Sheaffer 94231 pure (aucune dilution) afin de voir l’effet colorant. Le colorant affecte rapidement tout le matériel touché et ensuite diffuse lentement, sur plusieurs jours, dans le polymère.
La coloration atteint toutes les spores., mais n’a pas coloré les hyphes suspenseurs. Il semble que les hyphes « runner » aient transporté le colorant à l’intérieur des spores les plus éloignées, et que le colorant s’y accumule de manière à le rendre perceptible.
Les effets observés sont:
- 1) Suite au dépôt de la goutte, une tache noire se forme en quelque secondes et diffuse peu
- 2) L’encre diffuse lentement, sur plusieurs journées
- 3) Les spores sont colorées en noir au bout de quelques jours, même celle qui semblent éloignées du polymère encore teinté
- 4) Les hyphes suspenseurs et les petits hyphes ne semblent pas se faire colorer, ou très peu.
- 5) Certaines hyphes notamment les « runner » semblent se colorer en foncé. Ces hyphes présentent une circulation active malgré la coloration.
- 6) Aucune structure intraracinaire ne semble colorée ni révélée
Conclusion: L’encre utilisée de manière pure ne semble pas apporter beaucoup d’information nouvelles. La coloration des « runner » suggère toutefois que les hyphes transportent le colorant pour l’emmener à l’intérieur des spores.
